Analisis Instrumental

Analisis Instrumental

Merupakan bagian dari Analisis Kimia yang pada tahap pengukuran menggunakan instrumen analitik untuk menentukan identitas, kemurnian dan kadar analit.

Manfaat                                                     Tujuan

-Industri : QC, Menentukan komposisi sampel          -Mengatasi sampel atau analit konsentrasi kecil

-Kesehatan : Diagnosis, Toksikologi, farmakologi     -Mempercepat hasil pengujian

-Riset : menentukan komposisi, sintesis, QC              -Mengatasi sampel dalam jumlah banyak

-Lingkungan : Menyelidiki cemaran pestisida,           -Otomasi pengujian                     

Logam berat, gas beracun , dll            -Elusidasi struktur suatu senyawa

-Menentukan komposisi campuran

Kebaikan                                                   Keburukan

1.    Sensitif : ppm, ppb                                                1. Perlu baku pembanding

2.    Cepat                                                                     2. Ketergantungan listrik

3.    Pengukuran lebih mudah dan nyaman                  3.investasi mahal

4.    Otomasi dimungkinkan

Macam-macam metode dalam Analisis Instrumental:

1.    Spektrofotometri : UV, Infra Red ( IR ), Fluoresensi

2.    Kromatografi

  I.    Spektrofotometri

Merupakan metode analisis intrumental yang didasarkan pada intensitas cahaya dengan panjang gelombang yang hampir monokromatis yang digunakan, setelah berinteraksi dengan sampel atau zat uji.

E=hv=hc/ƛ

Transmitan adalah perbandingan antara intensitas cahaya yang keluar setelah berinteraksi dengan zat uji dengan intensitas cahaya awal sebelum berinteraksi dengan zat uji. T = I / I₀ dimana

T= Transmitan ; I= Intensitas cahaya yang keluar ; I₀ = Intensitas cahaya awal.

Serapan adalah banyaknya cahaya yang diserap setelah berinteraksi dengan zat uji.

A = -log T = log 1/T = log I₀ / I , dimana A= Serapan ; T = Transmitan

Hukum Beer → Besarnya serapan  dari larutan suatu zat berbanding lurus dengan tebal larutan dan konsentrasinya. A= abc , dimana A= Serapan ; a = daya serap ; b= tebal larutan ; c = konsentrasi

Hukum Beer dapat ditulis dengan 3 cara:

1.   A = abc                  c= konsentrasi (g/L) ; a= daya serap

2.   A =( A1%, 1cm)bc c = konsentrasi (%) ; A1%,1cm = daya serap jenis

3.   A = εbc                  c = konsentrasi , molar (M); ε = daya serap molar

A= serapan ; B= tebal larutan (cm)

Syarat Hukum Beer:

-Cahaya yang dipakai harus monokromatis    -Cairan yang diukur harus stabil

-Konsentrasi harus rendah                              -larutan yang diukur harus jernih

Penyimpangan hukum beer juga berkaitan dengan kemampuan detektor untuk mendeteksi cahaya yang berasal dari larutan yang terlalu pekat atau terlalu encer. Kesalahan terkecil bila A = 0,4343 atau T= 36,8%. Kesalahan masih dapat diterima bila serapan A= 0,2 – 0,7 atau T = 20 – 60%.

Absorpsi dan emisi cahaya terjadi karena transisi energi pada atom maupun molekul. Absorpsi adalah transisi energi dari energi tingkat dasar ( ground state) ke tingkat energi yang lebih tinggi (excited state). Absorpsi terjadi karena adanya rangsangan cahaya dengan energi yang sama dengan selisih energi (ΔE) dari kedua level energi tersebut. Banyaknya cahaya yang diserap berbanding lurus dengan junlah atom atau molekul yang dilewati cahaya tersebut.

Untuk spektrofotometri sinar tampak, larutan sampel yang digunakan harus berwarna.

ƛ nm	Warna	Warna komplementer
400-435	Violet	Hijau kekuningan
435-480	Biru	Kuning
480-490	Biru kehijauan	Jingga
490-500	Hijau kebiruan	Red
500-560	Hijau	Ungu
560-580	Hijau kekuningan	Violet
580-595	Kuning	Biru
595-610	Jingga	Biru kehijauan
610-750	merah	Hijau kebiruan

Pada tabel, yang dimaksud warna adalah warna cahaya yang keluar setelah melalui filter, sedangkan warna komplementer aalah warna larutan sampel yang akan diukur.

Spektrofotometri dibagi menjadi 2 macam:

I.     Spektrofotometri Serapan                   II. Spektrofotometri Emisi

A.     Serapan Molekul                              A. Emisi Molekul : Spektrofluorometri

·         Vis Spectrofotometry                         B. Emisi atom : AFS

·         UV-Vis Spectrofotometry

·         IR Spectrofotometry

B.     Serapan Atom

·         Atomic Absorption Spectrofotometry ( AAS)

II.   UV-Vis Spectrofotometry

Bisa digunakan sebagai spektrofotometer pada daerah sinar tampak atau sinar UV.

Aplikasinya:

·         Analisa Kualitatif : Mendapatkan spektrum serapan, spektrum relatif, besar ƛ_maks , A1%,1cm , a, ε

·         Analisa Kuantitatif : Menggunakan Hukum Beer

·         Elusidasi struktur  : Spektrum serapan - kromofor

Kromofor: gugusan fungsional dari molekul yang mengabsorbsi cahaya dan mengandung satu atau lebih ikatan rangkap. Contoh : Benzen

Auksokro

Pergeseran Panjang gelombang:

1.      Pengaruh pelarut Polar

Transisi n – π^* terjadi pada ƛ yang lebih pendek ( Pergeseran biru / hipsokhromik)

Transisi π – π^*  terjadi pada ƛ yang lebih panjang ( Pergeseran merah / bato khromik)

2.      Pengaruh konjugasi

Menyebabkan tingkat energi orbital π^*  turun, energi <, ƛ_maks > (pergeseran batokhromik)

3.      Auksokhrom : Pergeseran Merah / batokhromik

Auksokrom adalah Gugusan Fungsional yang tidak begitu mampu menyerap cahaya, tetapi dapat merubah intensitas serapan menggeser ƛ_maks dari gugus kromofor suat molekul

 III.   IR Spektrofotometri

Merupakan spektrofotometri serapan molekul yang didasarkan atas pengukuran serapan radiasi infra merah oleh suatu zat. Daerah spektrum radiasi IR yang sering digunakan adalah mid IR.

Spektrum IR adalah grafik hubungan antara transmitan /absorben suat zat dengan frekuensi/ bilangan gelombang radiasi IR pada rentang frekuensi tertentu. Spektrum ini dapat menggambarkan gugus-gugus fungsional yang ada dalam zat tersebut dan secara keseluruhan merupakan spektrum yang sangat khas untuk zat tersebut sehingga bisa untuk identifikasi zat tersebut. Spektrofotometri IR banyak digunakan untuk analisis kualitatif untuk QC bahan baku di industri farmasi juga untuk elusidasi struktur suat senyawa. Interaksi suat zat dengan radiasi inframerah pada frekuensi tertentu menyebabkan terjadinya transisi energi vibrasi dan rotasi dari molekul suat zat.Karena itu spektrum inframerah juga disebut spektrum vibrasi.

Frekuensi vibrasi dan ikatan kimia: Posisi pita serapan atau bilangan gelombang ampel terjadinya transisi energi vibrasi gugus fungsional, dapat digambarkan dengan hukum Hook.

Jumlah pita serapan bisa saja bertambah atau berkurang bila pada kondisi tertentu. Fenomena yang menambah jumlah pita serapan adalah jika adanya overtones (kelipatan frekuensi tertentu) dan combination tones (jumlah dua vibrasi yang berlainan).

Fenomena yang mengurangi jumlah pita serapan adalah:

1.    Pita serapan di luar daerah mid IR

2.    Pita serapan terlalu lemah untuk diamati

3.    Beberapa pita serapan posisinya terlalu dekat sehingga bergabung menjadi satu

4.    Pada molekul yang sangat simetris akan terjadi regenerasi beberapa serapan pada frekuensi yang sama

5.    Perubahan molekul dipole tidak terjadi.

Intensitas serapan, yang dinyatakan dengan besarnya nilai transmitan atau serapan atau yang secara semikuantitatif dinyatakan dengan pernyataan kuat, sedang atau lemah, ditentukan oleh konsentrasi sehingga pada gambar harus dicantumkan konsentrasi sampel dalam medium yang digunakan. Intensitas juga dipengaruhi oleh dipole atau polaritas gugus fungsional. Semakin kuat dipole suatu gugus fungsional, semakin kuat pula serapannya. Kekuatan dipole atau dipole ampe adalah hasil kali muatan dengan jarak ikatan 2 atom. Makin polar suatu molekul, dipole momen makin besar sehingga frekuensi vibrasinya juga semakin besar.

Sumber cahaya:                                               Monokromator:                                   Detektor:

1.      Kawat Ni-Cr, 1100⁰C             1. Prisma                                 1. Fotodetektor: NIR

2.      Globar (SiC), 1200⁰C              2. Kisi (grating)                                   2. Thermal ampele: Mid IR

3.      Nernst Glower(ZrC), 1500⁰C

Sel: NaCl, KBr, AgCl

Keuntungan IR Spectrofotometer Double Beam:

-Adanya pembanding untuk mengkompensasikan kesalahan karena adanya tambahan serapan berkas radiasi inframerah oleh CO₂ H₂ O dari udara pada serapan sampel

-Meminimalkan radiasi percikan oleh partikel debu pengotor yang mungkin ada dalam spektrofotometer IR

-Mencegah pengaruh tidak stabilnya intensitas radiasi IR karena variasikondisi tegangan listrik atau intensitas sumber cahaya yang juga berdampak pada detektor

-memungkinkan pembacaan dan perekaman langsung

Interpretasi Spektra

Spektrum yang akan diinterpretasikan harus memenuhi syarat:

1.      Resolusi dan intensitas spektrum harus memadai

2.      Spektrum harus berasal dari zat murni

3.      Spektrofotometer harus dikalibrasi

4.      Teknik penyiapan sampel harus dijelaskan

Karakteristik gugus fungsional spektrum inframerah suatu zat diidentifikasi berdasarkan: Posisi atau frekuensi (cm^-1 ), bentuk (Broad), dan intensitas relatif serapan(Strong, Medium, Weak)

Untuk analisis Kuantitatif:

·         Kadar dihitung berdasarkan Hukum Beer.

·         Dengan metode standar Internal pada teknik cakram KBr, tentukan serapan relatif.

·         Absorban (A) ditentukan dengan : Baseline methode.

·         Kadar dapat ditetapkan dengan memplot absorben ke dalam kurva kalibrasi.

Namun Spektrofotometri IR jarang digunakan untuk analisis kuantitatif karena kurang sensitif.

Penyiapan sampel ( sampel :  padat, setengah padat , cair, gas):

1.   Sampel Padat

a)      Mull: 5-10 g zat + 1-2tetes nujol campur dan gerus dalam lumpang agate hingga seperti pasta. Kompresikan sebagai lapisan film diantara 2 sel NaCl transparan. Teknk ini muda, cepat, murah tapi ada gangguan spektrum nujol sehingga tidak cocok untuk analisis kuantitatif.

b)     Cakram Kbr: 1-2mg zat gerus hingga partikel <2µm, campur homogen dengan 300-400 mgserbuk kering KBr murni. Kompresikan dalam 10 Ton-Press sambil di vakum (7,5 . 10^-3 mmhg). Teknik ini cocok untuk analisis kuantitatif dengan menggunakan rasio bobot sampel dengan standar internal. Kelemahannya: pembuatan cakram agak lama dan perlu investasi  untuk alatpress dan pompa vakum.

c)      Film: plastik/resin, zat padat tertentu

- Lembaran plastik transparan langsung diukur

- Larutkan zat padat dalam pelarut volatil (kloroform), teteskan pada sel.

d)   Larutan : larutkan zat (1-10%) dlm CCl₄ atau CS₂ . ukur dengan sel untuk cairan dengan ketebalan tertentu.

e)   Teknik Refleksi ganda (AttenuatedTotal Reflectant/ATR).

      Sampel diletakkan di atas permukaan lempeng kristal bentuk prisma (AgCl atau talium bromo-iodida). Teknik ini digunakan untuk zat padat tanpa memperhatikan ketebalannya misal bulk materials , lapisan film dan studi permukaan.

2.      Zat setengah padat atau cairan kental

Langsung dapat diukur dengan dikompresikan antara 2 sel NaCl transparan seperti mull.

3.      Zat cair

Langsung diukur atau dalam bentuk larutan sepertiyang telah dijelaskan untuk larutan zat padat.

4.      Gas

Gas diukur menggunakan sel transparan tehadap radiasi inframerah (NaCl windows) dengan tebal optik lebih kuran 100 mm. Sel dilengkapi keranda divakumkan sebelum diisi sampel gas

 IV.     Spektrofluorometri

Merupakan spektrofotometri emisi molekul di mana cahaya yang diukur adalah intensitas fluoresens yang terjadi pada panjang gelombang tertentu (ƛ_emisi) setelah analit dieksitasi dengan cahaya pada panjang gelombang tertntu (ƛ_eksitasi). Digunakan Untuk analisis senyawa yang berfluoresensi, atau senyawa yang tidak dapat berfluoresensi namun dapat diubah menjadi senyawa yang dapat berfluoresensi. Molekul yang dapat menyerap cahaya dengan kuat adalah  senyawa aromatik, heterosiklik dan konjugasi.. Molekul yang tereksitasi kembali ke ground state dengan melepaskan cahaya dalam waktu kurang dari 10^-9 detik. Kebanyakan molekul kembali ke ground state dengan melepaskan panas sehingga tidak berfluoresensi.

Fraksi energi eksitasi yang diemisikan kembali sebagai fluoresens dinamakan efisiensi fluoresens atau kuantum yield of fluorescense, ɸ.

ɸ= Jumlah foton(cahaya ) yang diemisikan /Jumlah foton(cahaya) yang diserap.

ɸ=F/(I₀-I_T )=F/I_a =F/2,3 I₀ εbc  ;   F=2,3 ɸ I₀ εbc  =kc  di mana k = 2,3 ɸ I₀ εb

F=Floresensi  ;  I₀ =intensitas radiasi eksitasi  ;  I_T = Intensitas radiasi yang diteruskan  ;  I_a = intensitas radiasi yang diserap  ;  ɸ = Efisiensi ampelens ;  ε = daya serap molar  ;  b= tebal sel  ;  c=konsentrasi (M) ;  k=tetapan dari berbagai faktor.

Prinsip kerja:

1.      Cahaya polikromatis sumber cahaya diarahkan ke monokromator eksitasi

2.      Monokromator eksitasi diset pada ƛ_ex di mana analit menyerap cahaya cukup kuatdiarahkan ke larutan sampel

3.      Analit menyerap ƛ_ex lalu molekul analit berfluoresensi atau menghasilkan cahaya ƛ_em dengan panjang gelombang > ƛ_ex

4.      Momokromator fluoresens posisi 90⁰ diset pada ƛ_em untuk mencegah gangguan cahaya eksitasi dan cahaya hamburan dari sel atau pelarut.

5.      Detektor kemudian mengubah energi fluoresens menjadi sinyal listrik

6.      Amplifier memperesar sinyal listrikagar dapat disajikan pada display atau direkam dengan sprinter dalam bentuk intensitas fluoresens, spektrum eksitasi atau emisi.

Faktor yang mempengaruhi intensitas ampelens:

·         Kadar: fluoresens makin kecil bila kadar makin kecil

·         Energi eksitasi: makin kecil ampelens bila intensitas cahaya makin kecil

·         Sturktur planar: molekul planar dengan sistem konjugasi meningkatkan fluoresens

·         Metode iluminasi

·         Oksigen dalam larutan (quencher): makin tinggi kadar Quencher makin lemah ampelens

·         PH Penurunan PH meningkatkan fluoresens bentuk molekul dan menurunkan bentuk ion dari fenol.

·         Fotodekomposisi:Makin kuat serapan radiasi makin besar kesalahan karena penguraian oleh radiasi.

·         Suhu dan viskositas: Makin tinggi suhu dan makin kecil kekentalan, makin kecil fluoresens karena deaktivasimolekul tereksitasi oleh kolisi.

Quenching: Deaktivasi non-radiatif dari molekul tereksitasi oleh suatu zat sehinggamenurunkan intensitas fluoresens. Zat tersebut dinamakan quencher.

Quencher dapat berasal dari matrik sampel atau pelarut

Sumber cahaya:

1.      Xenon arc lamp: nyala lampu terjadi karen ionisasi gas Xe dengan tegangan tinggi, kemudian arus dan tegangan dipertahankan 7,5A, 20 V(750W). Nyala lampu mencakup panjang gelombang UV-Vis. Kompartemen lampu didinginkan dengan kipas.Iradiasi UV terhadap O₂ menghasilkan O₃ yang toksis (peru ventilasi).

2.      Lampu Merkuri: Intensitas cahaya ini terkonsentrasi pada 254 dan 365 nm yang bermanfaat sebagai radiasi eksitasi.

Filter emisi: Untuk menyerap cahaya hamburan dari cahaya eksitasi. Untuk instrumen modern digunakan monokromator.

Sel: wadah larutan sampel untuk pengukuran, terbuat dari gelas atau silika. Tetapi dibawah 320 nm diperlukan sel kwarsa atau sel silika.

Detektor: mengubah energi cahaya menjadi energi listrik. Yang ering digunakan adalah phototube, photomultiplier tube, diode array detektor.

V.       Spektrofotometri Serapan Atom (SSA) atau Absorption atomic spectofotometry (AAS)

Adalah spektrofotometri yang didasarkan atas serapan energi radiasi oleh atom logam dalam bentuk gas pada level energi tingkat dasar. Metode ini dikembangkan oleh ilmuwan Australia, Walsh, pada tahun 1955. Metode ini bermanfaat untuk menetapkan kadar logam atau senyawa logam dalam konsentrasi kecil dalam matriks yang kompleks, misalnya : multivitamin mineral, sampel biomedik, polutan logam dalam air, makanan dan minuman dll.

Ada 2 macam AAS berdasarkan metode ionisasinya:

1. Flame AAS: larutan sampel disemprotkan ke dalam nyala

2. Non-flame atau flameless AAS: menggunakan tetesan sampel dan energi listrik (grafit pijar) untuk atomisasi. Lebih sensitif.

Kebaikan                  Keburukan

-selektif                       -destruktif

-sensitif                       -perlu energi

                                    -bahaya kebakaran

Atom logam dalam bentuk gas pada level energi tingkat dasar dapat menyerap sejumlah energiradiasi tetentu sesuai dengan jumlahatom logam atau konsentrasi mengikuti hukum Beer.

A= abu atau A = kc

Suhu pada proses atomisasi ditentukan oleh jenis dan komposisi atau perbandingan antara bahan bakar dan oksidan. Bila suhu yang digunakan terlalu panas, bisa terjadi ionisasi, tetapi bila kurang panas, proses atomisasi belum berjalan sempurna.

Garis Resonansi: Garis yang timbul karena terjadinya transisi dari keadaan dasar ke energi yang lebih tinggi

Hukum Lambert-Beer dapat dipakai pada metode SSA bila garis resonansi atom yang dianalisis memberi puncak yang sama (mendekati) dengan spektrum pancaran sumber radiasi.

Keberatan terpenuhinya persyaratan Hukum Beer pada SSA karena Setiap unsur perlu sumber radiasi tertentu. Untuk mengatasinya dipakai monokromator beresolusi tinggi sehingga dengan satu  sumber radiasi bisa untuk berbagai unsur. Sumber radiasi yang banyak dipakai: Hollow Cathode Lamp ( HCL). Namun setiap unsur masih perlu lampu katode tersendiri. Untuk analisis lebih dari satu unsur diperlukan lampu katoda berongga kombinasi.

Macam-macam gangguan pada AAS:

·     Gangguan Spektra.

- Bila frekuensi garis resonan analit overlap dengan garis emisi  dari unsur lain.

- Adanya spektrum emisi dari molekul atau fragmen molekul (OH atau CN) pada nyala

- Gangguan spektra lebih banyak terjadi pada spektrofotometri Emisi nyala (FES)

·     Gangguan kimia

a. Terbentuknya senyawa stabil -> sukar  terurai menjadi atom

-Adanya sulfat atau fosfat pada penetapan kadar Ca.

Pembentukan oksida yang sukar melebur dan stabil (refractory oxides): oksida dari Al,Ti, V

Cara mengatasi:

Naikan suhu nyala: gunakan asetilen-N₂ O

-Gunakan releasing amp misalnya penambahan SrCl₂ atau LaCl₃ untuk mengikat fosfat pada penetapan kadar Ca.

-Gunakan masking agen untuk mengikat analit (Ca) agar tidak bereaksi dengan pengganggu (sulfat atau fosfat)

-Ekstraksi analit atau zat pengganggu

b. Ionisasi

-Ionisasi logam alkali dan alkali tanah menurunkan jumlah atom sehingga serapan berkurang.

Cara mengatasi: Gunakan ionisation suppresant yaitu kation dengan ionisasi potensial yang lebih rendah dari analit. Misalnya penambahan ion kalium pada penetapan Ca, Ba, atau Sr.

c. Absorpsi Molekul

NaCl menyerap radiasi pada ƛ disekitar garis resonansi Zn (231,9 nm) sehingga mengganggu penetapan kaar seng.

Cara mengatasi: gunakan garis resonansi (ƛ) alternatif atau gunakan nyala dengan suhu yang lebih tinggi.

d. Background absorption. Disebakan oleh serapan molekul atau hamburan cahaya dari: fragmen molekul, molekul gas, partikel asap bila digunakan pelarut organik.

Cara mengatasi: Gunakan cahaya kontinu dari lampu D₂  yang membentuk berkas cahaya ganda dengan cahaya dari sumber cahaya. Background absorption mempengaruhi ampel and reference beam. Koreksi dilakukan dengan mengukur rasio dari intensitas kedua berkas cahaya tersebut.

·    Gangguan fisika.

Disebabkan oleh efek matriks yang berpengaruh terhadap sifat fisika sampel seperti: kekentalan, bobot jenis, tegangan muka atau sifat menguap dari larutan sampel. Hal ini berpengaruh pada ukuran partikel aerosol pada atomisasi.

Cara mengatasi: Gunakan matrix matching yaitu pelarut yang sama dengan komposisi matriks yang hampir sama.

Perhitungan penetapan kadar:

a.  Kurva kalibrasi

Bila kurva linier, kadar langsung dihitung dari kurva kalibrasi atau persamaan regresi

b.  Penambahan baku pembanding (Standard addition method)

c.  Metode ini digunakan untuk sampel dengan matriks kompleks atau komposisinya tidak diketahui sehingga kondisi larutan baku tidak mungkin dibuat sama.

Tugas Analisis Instrumental

Ringkasan

Nama: Ricky. Kurniawan

NPM: 2010210226

Fakultas Farmasi

Universitas Pancasila